實驗操作因素對ELISA結果的影響
ELISA測定一般遵循以下步驟:固相包被→加樣品→溫育→洗滌→加酶結合物→溫育→洗滌→加底物→溫育→顯色→終止顯色→比色
目前各種形式的ELISA自動分析儀已經進入市場,如廣泛應用于血站系統的微板式全自動酶免分析儀,其試劑為開放式的,而對于其它類型的,則試劑和儀器往往是配套的。但當前大部分醫學實驗室均采用手工操作加儀器測定的方式。ELISA操作步驟復雜,操作不當將引起較大的誤差。以下敘述各個步驟中的影響因素。加樣器是一種比較精密的工具,其在長時間使用時會因機械磨損或者推動桿內附著血痂等原因造成加樣不準,尤其是對于樣本量較大的臨床實驗室,因此必須定期對加液器進行維護和校準。每次加不同的標本時均需更換吸嘴,以免發生交叉污染。加樣時速度不可太快,避免將標本加在孔壁上部,并注意不要濺出或產生氣泡。加樣時還應當注意操作時差對結果的影響,操作時差是指加入標本、試劑及混勻時間的差異。遠慕生物供應： 操作時差在每個實驗中都存在,尤其是手工操作,日常檢測標本多達幾百個,從加入*個標本到zui后一個標本,需幾十分鐘,加入試劑及混勻等均存在著前后時間差異,使抗原抗體反應和酶促反應時間不一致,操作時差對競爭法檢測的結果影響更大,在加酶結合物和底物時可用定量多道。
正式試驗時，應分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件，待檢樣品應作一式二份，以保證實驗結果的準確性。有時本底較高，說明有非特異性反應，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。ELSIA操作步驟復雜，影響反應因素較多，特別是固相載體的包被難達到各個體之間的一致，因此在定量測定中，每批測試均須用一系列不同濃度的參考標準品在相同的條件下制作標準曲線。測定大分子量物質的夾心法ELISA，標準曲線的范圍一般較寬，曲線zui高點的吸光度可接近2.0，繪制時常用半對數紙，以檢測物的濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，將各濃度的值逐點連接，所得曲線一般呈S形，其頭、尾部曲線趨于平坦，中央較呈直線的部分是的檢測區域。
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