常規的PCR擴增需要進行細菌培養、質粒制備等多步操作后才能進行基因擴增,操作繁瑣耗時較長,同時在反復的操作中DNA量損失也較大,產率較低。在1989年 Gussow Clackson3建立了菌落PCR( colony PCR)法,菌落PR與我們通常的普通DNA的PCR的不同在于,直接以單個菌作為模板。是一種可以快速鑒定菌落是否為含目的質粒的陽性菌落,操作簡單,快速,在轉化鑒定中較常用。
PCR原理
常規的PCR需要專門制備DNA模板,面菌落PCR可直接以單個菌落作為模板,用無菌牙挑取單個菌落到TE級沖液中,煮沸10mn,渦旋振蕩后短暫離心,用1-2pl裂解液作為DNA模板,省去抽提模板DNA這一步,通過特異性引物或通用引物對目的基因進行快速擴增大大節約了時間和成本
材料選擇
1.固體平板培養基上培養出的單菌落
②10XPCR緩沖液(100mmol/ L. Tris-HCL, pH8.3,500 mmol/L KCL;0.1%明膠;15mmol/LMgCl2)。
③目的基因引物
④高壓滅菌牙簽
⑤抗性平板。
⑥ Triton x100
7.EP管
8.離心機
操作方法
①用高壓滅菌的牙簽挑取單個菌落,先在含抗性的平板上畫線,做保種用,然后將牙簽置于2 Intar×100中攪和一下,以便懸浮涂在牙簽上的菌,將相應的菌和平板上的畫線區做上對應的②將裝有20 u Triton×100的EP管煮沸10min,冷卻后120r/min離心lmin去除細胞
③反應體系(25ul)
Taq酶(5U/ul） 0.5ul 引物P2(10umol/L） 0.5ul
10×Taq緩沖液 2. 5ul dNTPs(各 2. 5mmol/L) 2ul
模板
引物Pl(10mo/L) 0.5ul
④PR擴增條件:95℃ 5min 94℃ 30s, 55℃ 30s,72℃ 60s,30循環;72℃5min;4℃
⑤電泳,觀察結果,對陽性的結果相對應的主平板上的菌落保種或者進行測序。
注意事項
①菌落PCR時,加入菌液模板的體積不能過大,否則會影響PCR體系,導致擴增失敗,般取1~2l做25l的PCR體系,模板如果太多了,引物就不夠用了,顯然擴增不出來,這種現象在以質粒為模板的PCR里面很多,提出來的質粒不要忘記稀釋
②減少擴增循環,25-30個循環對于菌落PCR是比較合適,擴增循環過多,會產生假
③假陽性的控制。如果用載休引物來擴增一般可以降低假陽性,或者多用幾對不同的引物擴增,以增加真陽性的篩選結果,PCR結果最好做酶切鑒定
④PCR條件的控制。熱啟動可以消除引物二聚體,退火溫度可以低
PCR應用
1.挑取重組子克隆
常規的堿裂解和煮沸法( Sambrook,1989)12均需要經過菌體過夜培養、菌體裂解及乙醇沉淀過程。一般情況下,在挑取的若干克隆中只有少部分為重組子,因此提取質粒過程消耗的時間很多,而利用菌落PCR挑取重組子克隆的過程則避開了提取質粒的繁瑣過程。陳淑霞等人口利用單菌落PCR法直接篩選含有綠色熒光蛋自基因( green fluorescent protein,GFP)和不耐熱腸毒素B亞基和耐熱腸毒素融合基因( LTB-ST)外源基因的重組克隆,陽性克隆可以擴增出目的條帶,和質粒PCR擴增進行比較結果一致。證明單菌落PCR進行重組菌陽性克隆的鑒定是非常有效的
2.基因組測序
傳統的測序首PCR擴增是以堿裂解等方法抽提的DNA為模板,成功率高但較為繁瑣,采用菌落PCR方法,將樣品跳過DNA抽提這一步,直接以菌體熱解后暴露的DNA為模板進行PCR擴增和熒光標記,使建庫到測序前各步驟的總成本減少了1/3,唐曄盛等釆用該法成功測定了秈稻( Oryza sativa indica)廣陸矮4號的L173號 BAC DNA全長序列
總結
常規PCR技術是目前分子生物學中的一種常用的鑒定方法和技術手段,在嚴格操作的前提下,PCR的結果是十分可靠的,但常規PCR擴增需要一些前期準備工作,如DNA模板的制備與純化,操作繁瑣,耗時費力,成本較高,而且DNA制備過程中的某些試劑會對擴增帶來不良影響。因此,菌落PCR為簡便快速地篩選DNA陽性重組克隆以及大規模基因測序等提供了一個簡便、高效的途徑.
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