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多重qPCR探針的熒光基團的基本要求

1. 避免熒光基團相互干擾

多重qPCR的實驗設計要求比單一反應體系的要復雜的多。檢測不同指標的探針必須攜帶不同光譜范圍的熒光基團。下圖是幾種常用的熒光基團的發射光譜，很多熒光光譜相近的熒光基團，它們雖然最大發射波長不同，但是在附近的波段內還是會有相互重疊的，一定要避免熒光基團發射光譜之間的相互干擾。

2. 根據熒光強度分配檢測指標

不同熒光基團的熒光強度是有高有低的，例如FAM就是一個熒光強度相對較高的基團，我們偏向于將其安排給相對表達量比較低的目的基因，而熒光強度相對較低的基團可以用于檢測表達量比較高的如看家基因等，這樣會達到擴增曲線平臺期接近的目的，結果會比較美觀。

3. 按照熒光定量PCR儀來選擇熒光基團

不同熒光定量PCR儀的激發光和發射光都是不相同的，因此需要根據對應的儀器選擇適配的熒光基團。目前廣泛通用的熒光基團為FAM（FITC），因此，絕大多數多重qPCR策略shou選的一個通道為FAM。如果使用儀器不適配的熒光基團，則在此之前必須對儀器針對這種熒光基團進行矯正。目前，主流的熒光定量PCR儀還是能夠支持較多通道的多重檢測的，小編根據IDT的數據進行了整理，貢獻出下表供您選擇：

4. 搭配淬滅基團的選擇

在選完探針的熒光基團之后，根據熒光基團的種類搭配淬滅基團即可，多重qPCR并不要求淬滅基團的不同，例如兩重qPCR分別選擇了FAM及VIC作為熒光基團，淬滅基團可以統一選擇BHQ-1。

多重qPCR還需要優化引物探針序列的特異性，防止其相互產生干擾；確定最佳的引物-探針比值等等工作。正常情況極限不超過4重，超過4重的會比較困難。